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              細胞計數實驗(細胞計數實驗)

              原理
              細胞懸液制備后,需要計算懸液中所含細胞數量;一般以細胞數/mL 表示。因只有健康的細胞才有活力,接種后能夠生長增殖,所以在接種關應先檢查一下細胞的活力。
              材料與儀器
              器材:培養液吸管
              試劑:細胞懸液、臺盼藍、酒精。
              步驟
              (1) 計數板
              用 96% 酒精沖洗計數板后,用干凈鹿皮擦凈,另擦凈蓋片一張;把蓋片覆在計數板上面,使之微微移向一側,露出計數板臺面少許,以便滴加細胞懸液。
              (2) 染色
              取吸管 1 支,伸入培養瓶中,輕輕反復吹打細胞懸液使細胞重懸均勻后,立即吸細胞懸液少許,向另一離心管中滴入細胞懸液 9 滴,再滴入臺盼藍染液 1 滴,混勻,置 2~3 分鐘。
              (3) 加懸液
              把計數板平放在顯微鏡臺上,立即從計數板邊緣輕輕滴 1~2 滴已染色的細胞懸液,使之充滿計數板和蓋片間空隙中。
              (4) 鏡檢
              鏡下觀察可見細胞分散各處,健康細胞胞體完整,透明不著色,凡著色細胞均為不健康者。計算四角大方格內的細胞數;壓中線者只計算左線和上線者,右線和下線不計算在內(即僅計算壓兩個邊的細胞)。
              (5) 接種
              培養通過計數測知懸液中細胞數后,可根據實驗所需細胞數量向培養容器中接種。細胞接種數量隨實驗目的、血清含量和細胞生物性狀而定;一般接種量在 1~10 × 105 細胞/mL 范圍,實驗周期短,希望細胞增殖較快時,接種量可大些。用含血清量大的培養液培養胚胎來源細胞、無限細胞系和惡性細胞系時,細胞接種數量不宜太大。
              注意事項
              (1) 向計算板中滴細胞懸液時要干凈利落,勿令液面蓋過蓋片,加量要適當,過多易使蓋片漂移,過少易出現氣泡,不理想時應重做。
              (2) 鏡下計數時,偶見有由兩個以上組成的細胞團,應按單個細胞數計算,如細胞團數占 10% 以上,說明消化不充分;功細胞數少于 200 個 / 10 mm2 或多于 500 個 / 10 mm2 時,均說明稀釋不當,需重新制備細胞懸液,再重計數。
              (3) 經常使用同一細胞在相同條件下工作時,對各種情況已做到心中有數情況下,可略去某些環節,如染色檢查等;計算板計算細胞數法有一定誤差,用作測定細胞生長曲線時,每一樣品應重復計算 4 次,取均值,較為可靠,若有電子細胞計數儀器當然更好。
              (4) 體外培養細胞在懸液中呈圓形,平均直徑 8~10 μm,當被接種到底物上生長時,經過延展后,則呈扁形,在底物上所占的面積按直徑算可達 20~25 μm,則 1 cm2 的底物上可容納 4~5 萬個這樣的細胞,這是理論上的數值,但在實際應用中,當細胞達到 80 % 匯合狀態時便應做傳代處理,因此細胞數量比上述理論數量少。
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